我們使用 pBAtC 向量 (加入編號 KU213971)和 Aar<br><br>I介導的sgRNA克隆系統(Kim等人,2014年)為Agrobac-<br>在佩妮的特米里調解的轉換。幻影玫瑰。的<br><br>ACO1-sg1 的目標 sgRNA 序列作為插入<br>退火寡核苷酸進入AarI消化的pBAtC向量<br>在 AtU6 啟動器和 sgRNA 支架之間,然後<br>迴圈與T4 ligase孵化(新英格蘭生物實驗室,<br><br>伊普斯威奇)在室溫3小時。退火寡利哥努-<br>核苷酸產物是使用含有混合物的<br><br>以下目標寡核苷酸的100 lmol/L<br>條件:95 °C 5分鐘,線性梯度從95°C到25°C<br>70 分鐘,在 10°C 下保持。ACO1(第 1 項)目標<br>sgRNA (gx20) 序列在<br>阿拉伯的阿利亞納-U6推廣者,和人類合作優化<br>鏈球菌類球基因Cas9(SpCas9)表達被控制<br>由35S促進者。
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